3세대 유전자가위로 인간 배아에서 돌연변이 유전자 교정 3

요약: 인간 배아세포를 교정하다. 기초과학연구원(IBS) 유전체교정연구단장인 김진수 교수(공동 교신저자), 오레건보건과학대(OHSU, Oregon Health & Science University)의 슈크라트 미탈리포프(Shoukhrat Mitalipov) 교수(공동 교신저자) 등, 한·미 과학자들이, (1) 대대로 유전되어 내려와 젊을 때(20-30대) 비대성 심근증(돌연사)을 일으키는, 4개의 염기 쌍이 망가져 결실된(deleted) 돌연변이 유전자인 MYBPC3를 가진 정자와, (2) 이 변이된 유전자를 자르는 3세대 유전자 가위(Cas9+crRNA)를 리보핵산단백질(RNP)로 조립해(표적 이탈을 줄이기 위해), (1)의 정자와 (2)의 RNP를 동시에 모계의 정상적인 난모세포(oocyte)에 마이크로주입(co-microinjection)하면(모자이크 현상을 피하기 위해), 교정을 위해 외부에서 주입된 인조합성(synthetic) 주형 DNA or gene 도움 없이도, 난모세포가 갖고 있는 대립유전자 염기서열을 템플릿(주형)으로 스스로 이용해서, 유전자 가위에 의해 잘린 정자 유래의 변이 유전자를 정상 염기들로 복구하여(HDR이 NHEJ보다 우세하게 일어나), 그 이후 분열이 일어나 성장된 배아 58개 중 42개(72.4%)가 정상임을 확인하였다. 이 배아들은 착상시키지 않고 폐기함에 따라 유전자가 정상으로 바뀐 아기가 실제로 탄생하지는 않았다.

이 연구 결과는 2017년 8월 2일자 네이처지 온라인판에 논문을 게재했는데, 인간 배아에서의 병을 일으키는 돌연변이 유전자를 교정하는데, 효율성, 정확성, 안전성을 증빙한 것이다. 이 연구 성공으로 심장병을 포함한 1만가지가 넘는 유전질환의 대물림을 막을 수 있는 길을 열었다는 평가를 받고 있다.

안타까운 것은 국내에서는 인간 배아 유전자를 교정하는 연구가 불법이기 때문에, 한국의 유전자 가위 기술을 미국에 보내 미국에서 교정 실험이 이루어졌으며, 실험 후의 데이터 분석은 한국에서 이루어졌고 그 결과를 미국에 보내 종합해서 논문을 발표했다는 것이다. 또한 대부분의 외신은 기술과 데이터 분석을 제공한 김진수 교수 팀보다는 슈크라트 미탈리포프 교수 팀의 성과로 보도했다는 점으로, 우리 나라 관점에서 반성하고 앞으로 나아갈 방향에 시사하는 바가 크다.

이번 연구 내용은 차후 유전자 가위의 응용 및 활용 편에서 자세히 소개할 예정이며 유료보고서로 디자인하여 출간할 예정이다. 본 보고서에서는 이번 발표된 ‘3세대 유전자 가위로 병을 일으키는 인간 배아에서의 돌연변이 유전자 교정’이란 논문을 자세히 분석해보고 나름 대로의 인사이트와 앞으로 나가야 할 방향을 제시하고자 한다. 아울러 논문분석이기 때문에 필자의 지식관점에서 오류가 있을 수도 있다는 점을 분명 알려드리는 바이다.

▲이미지 출처: 서울대/wikipedia.

[글 싣는 순서]

1장 논문 요약, 연구방법 모색 및 비대성 심근증(HCM)을 일으키는 MYBPC3의 돌연변이를 표적 1절 논문 요약 2절 비대성 심근증(HCM)과 현재 치료 방법, 새로운 방법의 고찰 3절 우리 몸의 자연적인 DNA 복구 메커니즘(NHEJ/HDR)과 모자이크 현상 4절 정상인 난모세포와 4개의 염기 쌍이 빠진 정자의 MYBPC3 돌연변이를 표적 5절 난모세포의 대립유전자를 이용 HDR이 우세하게 복구, 정자와 CRISPR-Cas9을 난모세포에 동시에 주입해 모자이크 현상 최소화

2장 4개의 염기 쌍이 빠진(삭제된, 결실된, ΔGAGT) 이형접합적 MYBPC3를 표적 1절 HCM 성인환자의 피부이용 유도만능줄기세포들( iPSCs)에 대한 테스트 2절 RNPs로 난모세포와 정자의 수정란 배아의 교정과 HDR 효율 3절 모자이크를 제거하는 수정 전 생식세포들을 표적 4절 복구(수선, 교정)된 배아의 발달과 세포 유전학 5절 복구(수선, 교정)된 인간 배아들에서의 비-표적(표적 이탈)의 중요성

3장 논문에 기술된 Discussion

4장 인사이트와 차후 도전과제와 생명윤리법 규제완화 1절 인사이트 2절 차후 도전과제 3절 배아교정연구 규제완화와 우리나라의 도전과제

2장 4개의 염기 쌍이 빠진(삭제된, 결실된, ΔGAGT) 이형접합적 MYBPC3를 표적

2절 RNPs로 난모세포와 정자의 수정란 배아의 교정과 HDR 효율

연구팀은 그 다음으로, 건강한 기증자 난모세포에 MYBPC3 돌연변이를 가진 환자의 정자를 수정(fertilization)시킴으로써 생산된 인간 접합자(human zygotes)를 대상으로 CRISPR–Cas9의 표적 결과를 평가했다. 다시 말해 수정란을 대상으로 연구했다.

연구팀은 이번에는 김진수 교수(공동 교신저자)가 개발하고 효율을 입증한, 플라스미드 대신 리보핵산단백질(RNP, ribonucleoproteins)을 사용해(adopted), sgRNA와 Cas9과 ssODN의 혼합체(mixture)를 수정 후 18 시간이 지난 전핵성 단계 접합체의 세포질(the cytoplasm of pronuclear stage zygotes 18 h after fertilization)에 미세바늘로 마이크로 주입 시켰다(microinjected).

김진수 교수 연구팀은 그 전에 돌연변이유발(유도) 시 플라스미드 DNA 형태가 아니라 RNP 형태로 주입하면 더 표적 정확도를 높이고 비-표적 확률은 낮출 수 있다는 것을 증명했는데, 2013년에 Cas9-sgRNA를 재조합 한 RNPs를 C-엘레강스에 집적 주입해서 유전자를 높은 정확도로 제거/억제 시켰으며(Knock-out)(Cho et al., 2013), 2014년에는 Cas9 RNPs를 인간 세포에 직접 주입해 고효율의 게놈 수정을 보고했고(Kim et al., 2014), 2016년에는 3.5세대 유전자 가위인 Cpf1을 RNPs의 형태로 사용하여 표적 사이트에서만의 정확한 돌연변이를 유도할 수 있어, 그 결과 비-표적(표적 이탈) 효과들(Off-target effects)을 획기적으로 줄일 수 있다는 새로운 메커니즘을 밝혀냈고(Kim et al., Nature Biotechnology, Aug 2016), Cpf1 RNPs를 이용해 표적에서만 일어나는 돌연변이 마우스의 생성을 보고했었다(Hur et al., Nature Biotechnology, Aug 2016)

Cas9 단백질은 DNA보다 빨리 분해되기 때문에 DNA를 자를 충분한 시간적 여유가 없어, 표적 사이트 이외의 비-표적 사이트를 자를 시간이 없으므로, 비-표적(표적 이탈) 효과를 줄일 수 있다,

수정 후 S-단계에 CRISPR-Cas9-주입된 접합자들(Zygotes S-Phase)과 주입하지 않은 손상되지 않은 대조군들(intact controls)을 3 일 동안 배양하고, 그 이후 4-8개의 세포들로 분열된 단계의 배아들을 선정해 염기서열분석(시퀀싱)으로 분석하였다(<그림 1>).

CRISPR-Cas9의 세포질 미세주입(마이크로주입)은 육안으로 확인됐고(), 수정 후 S-단계에 주입된 접합자들 중 97.1 %(68/70)의 생존율을 보였으며, 대조군과 비교하여 발달 속도가 효율적으로 나타났다().

▲<그림 1> 제2 감수분열 중기 II(metaphase II, MII)의 난모세포들은 이형접합적 환자의 정자에 의해 수정됨. 수정 후 18 시간이 지난 세포주기의 S-단계에서 CRISPR-Cas9를 인간 접합자들에 RNPs로 미세주입하여 MYBPC3 ΔGAGT 유전자를 표적으로 하는 도식화. 그 다음 4-8개로 세포로 분열된 단계의 배아들을 선정하여 분석을 함. 그 결과 WT/Mut(표적이 안된 배아)와 WT/NHEJ(인델이 유도된 배아)와 WT/HDR(장상 수선된 배아)이 섞여 있는 모자이크 배아를 24% 초래함. Image: Ma et al., Nature, Published online 02 August 2017.

Video 1: Video: CRISPR/Cas9 injection into human oocytes and zygotes http://www.nature.com/nature/journal/vaop/ncurrent/fig_tab/nature23305_SV1.html http://www.nature.com/nature/journal/vaop/ncurrent/extref/nature23305-sv1.mov

▲ CRISPR-Cas9을 수정 후 S-단계 접합자(Zygote S-Phase injection)와 수정 전 M-단계 난모세포에(MII M-Phase injection)에 주입하는 영상. Image: Ma et al., Nature, Published online 02 August 2017.

CRISPR-Cas9을 주입하지 않은 대조군 그룹과 CRISPR-Cas9를 수정 후 접합자(Zygote injection)와 수정 전 난모세포(MII injection)에 주입 후의 인간 난모세포들과 접합자들의 발달 현황표(Data: Ma et al., Nature, Published online 02 August 2017)

에서 4-8개의 세포들로 분열된 19개의 대조군 배아들에서 83개의 개별 할구들(83 individual blastomeres)을 시퀀싱한 결과, 9개(47.4%)의 배아들이 동형접합적 WT로 나타났고(MYBPC3 WT/WT), 10개(52.6%)의 배아들은 모계 WT와 부계의 돌연변이 유전자를 보유한 이형접합적으로(MYBPC3 WT/ΔGAGT) 나타났다(<그림 2a>).

이는 무엇을 의미하는가 하면 CRISPR-Cas9이 주입되지 않은 자연적인 대조군에서는 염기 4쌍이 삭제된 부계의 돌연변이 유전자가(ΔGAGT) 52.6%로 대물림을 한다는 것을 의미하는 것이다. 반면 모계의 정상 WT 염기서열로 복구된 정상적 아이는 47.4%로 태어난다는 것을 의미하는 것이다. 만약 모계와 부계 양쪽이 다 돌연변이이면 거의 100% 대물림 된다는 것을 시사하는 것이다. 그래서 인간 배아를 대상으로 유전자 가위로 돌연변이 유전자의 교정 연구가 필요한 것이다.

이러한 분포는 예상되었고, 이형접합적 환자의 정자 샘플은 유사한 운동성 및 수정 효율(similar motility and fertilization efficiency)을 가진 동등한 수의 WT 및 돌연변이를 가짐을 확인했다. 다시말해정상 50%와 돌연변이 50%의 수정 효율 분포를 가짐을 확인한 것이다.

반면, 수정 후 S-단계에 주입된 접합자들 중 에서 4-8개의 세포들로 분열된 54개의 배아들 중 36개(66.7%)는 WT/HDR의 동형접합적 WT로 나타났고(MYBPC3 WT/WT), 13개(24%)는 WT/Mut와 WT/NHEJ와 WT/HDR이 섞여있는 이형집합적인 WT/Mos의 모자이크로, 5개는(9.3%)는 유전자 가위의 영향을 받지 않은 WT/Mut의 이형집합적인 돌연변이로(MYBPC3 WT/ΔGAGT) 나타났다(<그림 2a>).

13 개의 배아들은 모자이크였고, 각각은 하나 이상의 유전자형(more than one genotype)을 가지고 있는 할구들(blastomeres)을 포함하고 있었다. 하나 이상의 유전자형이라 함은 WT/Mut(표적이 안된 돌연변이 배아), WT/NHEJ(인델이 유도된 배아), WT/HDR(정상 수선된 배아)이 섞여있는 상태를 말한다. 이러한 모자이크 배아들은 이형접합적(MYBPC3 WT/ΔGAGT)에서 유래되었다는 것을 제안하는 것이다. 놀랍게도, 8 개의 모자이크 배아들(<그림 2b>의 번호 1, 2, 4, 6, 7, 10, 11 및 12)에서 받달한 자매 할구들(sister blastomeres)의 대다수(majority)가 동형접합적인 모계의 정상(WT) 대립유전자(MYBPC3 WT/WT)에 의한 복구(수선)로 나타났다(<그림 2b>).

▲<그림 2a> 유전자 가위를 주입하지 않는 대조군 배아들과 수정 후 S-단계에 주입된 인간 배아들에서의 유전자 표적과 HDR 효율(Gene targeting and HDR efficiency in S-phase-injected human embryos). Image: Ma et al., Nature, Published online 02 August 2017.

▲<그림 2b> 13개의 모자이크 배아들에서 보여주는 자매 할구들(sister blastomeres)의 유전자형 결과. Image: Ma et al., Nature, Published online 02 August 2017.

<그림 2b>의 13개의 모자이크 배아들에서 WT/Mut(표적이 안된 돌연변이 배아), WT/NHEJ(인델이 유도된 배아), WT/HDR(정상 수선된 배아)의 전체 자매 할구들을 다 카운트하면 67개이고, 하늘색의 WT/HDR를 다 카운트하면 35개이므로, 전반적으로, 모자이크 배아들 내에서 각각 할구들의 동형접합적 WT/HDR 효율(MYBPC3 WT/WT)은 52.2 %(35/67)였다(<그림 2c>).

이 모자이크 배아들은 MYBPC3 WT/ΔGAGT 접합체에서 기원했기 때문에, 개별 할구들은 삽입된 ssODN 대신에, 모계 정상(WT) 대립유전자를 주형으로 사용하여 HDR에 의한 부계의 MYBPC3 ΔGAGT 결실을 복구했을 것으로 보인다. 이러한 결론은 ssODN이 주입되지 않은(-) 모자이크 배아들의 할구들에서 보정(correction)이 일어났다는 관찰에 의해 확증됐다(<그림 2b>). 다른 유전자형(genotypes) 중에서도 4 개의 모자이크 배아들(<그림 2b>의 번호 5, 8, 10 및 13)은 유전자 가위에 영향을 받지 않은 원래의 WT/Mut(17.9%)의 유전자형을 보이고 있는 반면(MYBPC3 WT/ΔGAGT), NHEJ의 복구 기전 특징으로 DSBs 사이트 부근에서의 추가적인 삽입(1bp, n=3)과 결실(1-20 bp length, n=16)을 나타낸 WT/NHEJ는 29.9%로 나타났다(MYBPC3WT/ΔGAGT-indel)(<그림 2c>)..

▲<그림 2c> 13개의 모자이크 배아들에서 67개 할구들의 다양한 유전자형(Various blastomere genotypes in mosaic embryos). Image: Ma et al., Nature, Published online 02 August 2017.

자 이번에는 표적 효율(targeting efficiency)을 보자. 인간 배아들에서의 전반적인 표적 효율은 72.2 %(13/18)로, 27.9 % (17/61)의 동일한 구조로 주입된 iPSCs보다 훨씬 높았다(<그림 2d & 2e>). 높은 이유는 iPSCs에서의 형질 주입(transfection) 방법은 ssODN, Cas9 및 sgRNA 가 모두 발현하는 플라스미드(plasmids)를 전기충격 혹은 전기천공(electroporation) 방법을 이용해 iPSCs에 주입한 반면, 수정후접합자(Zygote S-Phase injection)에 주입 방법은 미세 바늘튜브에 의한 마이크로주입(microinjection)을 했기 때문에 CRISPR–Cas9 의 구조가 보다 효과적으로 전달되었기 때문인 것으로 연구팀은 보고 있다.

▲<그림 2d> 수정란 S-단계 주입 배아에서의 전반적인 표적 효율 및 HDR 효율(Overall targeting and HDR efficiency in S-phase-injected embryos). n=18은 <그림 2a>의 Mut(n=5)+Mos(n=13)의 배아들이고, n=55는 Mos(n=13)의 67개 할구들 중 HDR(n=35)+NHEJ(n=20)의 할구들. Image: Ma et al., Nature, Published online 02 August 2017.

▲<그림 2e & 2f> 2e. iPSCs와 S-단계 주입 배아에서의 표적 효율. 2f. 유전자 가위를 주입하지 않은 대조그룹 배아들(n=19)과 S-단계 주입 배아들(n=54)에서의 정상(WT/WT)의 생성 효율. Image: Ma et al., Nature, Published online 02 August 2017. 더욱 주목할만한 것은, 표적 할구들(63.6 %, 35/55)의 대다수는 모계의 정상(WT) 대립유전자를 이용하여 HDR 기전(기작)에 의해 복구(수선)되었다는 것이며, 이것은 iPSCs에서 관찰된 외인성 ssODN-1을 이용한 HDR과는 현저히 다른 결과이다(<그림 2d> 및 ). 이것은 무엇을 의미하는가 하면 인간 배아세포에서는 유전자 가위가 iPSCs 세포와는 차별화된 다른 기전(기작)으로 작동하고 있다는 것을 의미하는 것이다.

연구팀은 또한 외인성 ssODN을 사용하여 HDR 기전으로 복구되고 있다는 증거를 찾지 못했으며, 이는인간배아에서는HDR이 모계의 정상 대립유전자에 의해 유도된다는 것을 제시하는 것이다.

이것은 무엇을 의미하는 것일까? 1997년에개봉된 SF 영화 가타카(Gattaca, 1997)의 환상이 깨졌다는 것이다. 아직까지는 말이다. 우성 정상 유전자들을 주입하여 언젠가는 맞춤식 아기가 탄생하겠지만, 이번 논문의 결과는 외부에서 주입한 ssODNs을 주형으로 하여 복구되지 않았는다는 것이 중요한 연구결과 중 하나라는 점이다.

▲ 인간 배아들과 iPSCs들에서의 DNA 복구(수선) 차별화. iPSCs와 비교하여 환자 배아에서 HDR 기반의 DNA 복구가 서로 다른 것으로 나타남. 인간 배아에서는 돌연변이 부계 유전자의 유도된 DSBs는 모계의 정상(WT) 대립유전자를 주형으로 사용하여 독점적으로 복구됨(수선됨)(63.6%, 그림 2d). 반면, iPSCs에서의 HDR은 외부 ssODN-1을 주형으로 이용해 복구가 일어남(41.2%, EDF 1e). Image: Ma et al., Nature, Published online 02 August 2017.

실제로 S-단계에 유전자 가위가 주입된 배아들의 66.7 %(36/54)는 동형접합적 정상의 WT/WT였으며, 이는 대조군의 비-주입 배아들에서 보인 47.4 %(9/19)보다 상당히 증가한 것이다(<그림 2f>). iPSCs에서의 관찰과 유사하게, 정상의대립유전자는모든인간배아들에서유전자가위의영향을받지않아손상되지않았는데, 이는 sgRNA의 특이성을 입증하는 것이다.

요약하면, 이러한 결과는 인간 접합자 내에서 유전자를 표적 하는데 CRISPR-Cas9 유전자가 매우 효율적이며, 돌연변이 부계 대립유전자에서의 DSBs가 주로 HDR을 통해 복구(수선)되었음을 분명하게 보여주고 있는 것이다. 더군다나 HDR은 모계 염색체 상에 존재하는 동형접합적 정상(WT) 대립유전자에 의해 전적으로 복구가 이루어졌다는 것이다. 이 결과는 인간 배아들은 체세포(somatic)나 iPSCs와는 다른 DNA 복구 메커니즘을 사용한다는 것을 시사하는 것인데, 아마도 생식세포(germline) 내의 게놈 충실도(genome fidelity를 엄격하게 통제하기 위환 진화론적인 요구들(evolutionary requirements)을 반영한 것으로 보인다.

차원용 소장/교수/MBA/공학박사/미래학자

아스팩미래기술경영연구소(주) 대표, (전)국가과학기술심의회 ICT융합전문위원회 전문위원, 국토교통부 자율주행차 융복합미래포럼 비즈니스분과 위원, 전자정부 민관협력포럼 위원, 국제미래학회 과학기술위원장